A la fin du XIXe s. s’est opérée une véritable prise conscience de la valeur du patrimoine artistique local. Plusieurs centres historiques de la Toscane, parmi lesquels Montalcino, ont entrepris de sauvegarder et de mettre en valeur les témoignages artistiques de la région. Les spoliations n’avaient pas manqué jusque là et se sont hélas prolongées pendant une partie du XXe siècle, de même que les ventes autorisées depuis une loi de 1881 (c’est ainsi que l’Annonciation d’Andrea della Robbia, provenant de Montalcino, est parvenue dans la collection d’Edouard André (1) grâce à l’intermédiaire d’un antiquaire siennois). Néanmoins, le noyau des œuvres ayant appartenu à l’ex couvent de Saint François a été mis à l’abri dans une « petite Pinacothèque Communale » ainsi mentionnée dans une note de la Préfecture de Sienne en date du 19 novembre 1897. Quelques années plus tard, la ville de Montalcino envoya 29 peintures, 7 sculptures et une douzaine d’objets d’art et de parements sacrés à la Mostra dell’antica arte senese (« Exposition de l’art siennois ancien ») organisée au Palazzo Pubblico de Sienne en 1904. Malheureusement, cette exposition marqua aussi le coup d’envoi de nombreux départs d’œuvres à l’étranger et au-delà de l’Atlantique. La totalité du patrimoine artistique de la région de Montalcino revint cependant sur place après la fin de l’exposition et permis à un groupe local d’amateurs, aidés du Surintendant de l’époque, Peleo Bacci, d’organiser une exposition d’art ancien à Montalcino en 1925. L’exposition fut à l’origine de la formation de deux collections muséales distinctes : d’une part la collection civique, qui demeura dans les salles du Palazzo Communale (mairie) et d’autre part, la collection diocésaine qui fut d’emblée installée dans les locaux de l’ancien couvent augustinien alors utilisé comme séminaire. C’est grâce à l’intervention d’Enzo Carli, Surintendant des Beaux-Arts de la Province de Sienne, que les deux collections furent d’emblée présentées dans des conditions remarquables. Carli inaugura la collection diocésaine en 1953, puis la collection civique en 1958. Celle-ci fut alors transférée au rez-de-chaussée de l’ancien Ospedale di Santa Maria della Croce (actuelle mairie).
En 1972, Enzo Carli publia le premier guide des deux musées, lesquels, à peine cinq ans plus tard, furent eux-mêmes réunis en une seule entité dans locaux de l’ancien couvent augustinien des Santi Filippo e Giacomo degli agostiniani, avec l’intention de former une collection plus importante qui permette de présenter un panorama de la production artistique, principalement celle de l’école siennoise, allant du moyen âge à la fin du XIXe s. Une restauration importante des bâtiments permit de transformer une vingtaine d’anciennes salles conventuelles en de beaux espaces d’exposition visant à mettre en valeur les oeuvres de la collection.